前言

人類自然殺傷細胞（NK） 占所有循環(huán)淋巴細胞的15％。NK細胞發(fā)現(xiàn)于20世紀70年代，主要與殺死感染的微生物和惡性轉(zhuǎn)化的同種異體和自體細胞有關(guān)。NK細胞表現(xiàn)出抗腫瘤細胞毒性，無需事先致敏和產(chǎn)生細胞因子以及調(diào)節(jié)各種免疫反應的趨化因子。人外周血NK細胞可分為CD56bright和CD56dim兩大類。CD56brightNK細胞通常被認為是低細胞毒性的細胞因子產(chǎn)生細胞，而CD56dimNK細胞則具有潛在的細胞毒性。由于NK細胞能夠識別和分解腫瘤細胞，以NK細胞為基礎的腫瘤免疫治療領(lǐng)域已經(jīng)到了一個激動人心的關(guān)頭。

嵌合抗原受體（CAR）是一種受體蛋白，它賦予免疫細胞新的能力，以靶向特定的抗原蛋白。它的細胞外抗原結(jié)合域通常為單鏈抗體（scFv），可以識別腫瘤細胞表面的特異性抗原。細胞內(nèi)激活的信號結(jié)構(gòu)域，如CD28、4－1BB（CD137）和OX40，通常起到觸發(fā)免疫細胞激活和殺傷的作用。表達CAR的T細胞能迅速識別腫瘤表面抗原，進而裂解腫瘤細胞。CAR－T細胞免疫治療在治療急性淋巴細胞白血�。ˋLL）、慢性淋巴細胞白血�。–LL）和淋巴瘤等血液腫瘤方面取得了巨大的成就。然而盡管CAR－T細胞免疫治療技術(shù)發(fā)展迅速，但在臨床應用中仍存在一些不足，例如在實體瘤的治療中顯示出很低的療效；此外，大多數(shù)的CAR－T細胞免疫療法需要自體過繼細胞移植，因為除非處理HLA屏障，否則異基因T細胞可能導致移植物抗宿主�。℅VHD）；另外，CAR－T細胞免疫治療可能會產(chǎn)生一些副作用，對患者的生命造成危害，如細胞因子釋放綜合征。最新的研究表明，表達CAR的NK細胞可能會克服CAR－T細胞的上述缺陷，并顯示出顯著的抗腫瘤作用。CAR－NK細胞在腫瘤的免疫治療中展現(xiàn)出廣闊的前景。

CAR－NK細胞免疫治療的優(yōu)勢

首先，在臨床應用中，CAR－NK細胞免疫療法比CAR－T細胞免疫療法更安全，而且NK細胞的安全性已在一些臨床領(lǐng)域得到驗證。例如，一些I／II期試驗顯示，同種異體NK細胞輸注耐受性良好，不會引起GVHD和明顯的毒性。因此，NK細胞是一種適應性更強的CAR載體，而不僅僅局限于自體細胞。

CAR－T細胞免疫治療的主要副作用之一是由于CAR－T細胞的持續(xù)存在而產(chǎn)生的靶向效應。相反，CAR－NK細胞的壽命很短，幾乎不會產(chǎn)生靶向效應。另外，NK細胞產(chǎn)生的細胞因子種類與T淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子種類有很大不同�；钴S的NK細胞通常產(chǎn)生IFN－γ和粒－巨噬細胞集落刺激因子（GM－CSF），而CAR－T細胞通常通過分泌促炎性細胞因子如TNF－α、IL－1和IL－6誘導細胞因子風暴。

第二，除了通過單鏈抗體識別腫瘤表面抗原來抑制癌細胞外，NK細胞還可以通過多種受體識別各種配體來抑制癌細胞，例如自然細胞毒性受體（NKp46、NKp44和NKp30）、NKG2D和DNAM－1（CD226）。這些NK細胞受體通常識別在免疫細胞或長期治療壓力下腫瘤細胞上表達的應激誘導配體。此外，NK細胞通過FcγRIII（CD16）誘導抗體依賴性細胞毒性。因此，CAR－NK細胞可通過CAR依賴和NK細胞受體依賴性途徑抑制癌細胞，從而消除腫瘤抗原陽性癌細胞或表達NK細胞受體配體的癌細胞。臨床試驗表明，CAR－T細胞不能消除高度異質(zhì)性的癌細胞，但是CAR－NK細胞能夠有效地殺死長期治療后可能改變其表型的殘留腫瘤細胞。

最后，NK細胞在臨床樣本中非常豐富，可以從外周血（PB）、臍帶血（UCB）、人類胚胎干細胞（HESC）、誘導多能干細胞（IPSC）甚至NK－92細胞系中產(chǎn)生。NK－92細胞提供了一個均勻的細胞群，并且可以在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下很容易地擴大，以進行廣泛的臨床應用。但是，由于其腫瘤細胞系來源，必須在輸注前進行輻照。相反，活躍的PB－NK細胞表達廣泛的受體，無需輻射即可利用，這使得它們能夠在體內(nèi)生成。來源于iPSCs或hESCs的NK細胞結(jié)合了PB－NK和NK－92細胞的優(yōu)點，表現(xiàn)出與PB－NK細胞相似的表型，是一個同質(zhì)的群體。更重要的是，通過采用非病毒轉(zhuǎn)基因方法，CAR可以很容易地在人胚胎干細胞和／或iPSC來源的NK細胞中表達。

CAR－NK細胞免疫治療的研究現(xiàn)狀

血液瘤

臨床前研究表明，CD19－CAR－NK細胞對血液系統(tǒng)腫瘤有很高的應答率，并且易于制造，與目前的CAR－T細胞免疫療法相比，這是一個巨大的進步。CD19－CAR修飾的NK細胞具有比CAR－T更明顯的優(yōu)勢，有望顯示出更好的抗腫瘤作用。除了CD19外，淋巴瘤和白血病的CAR－NK細胞臨床研究也針對CD7（NCT02742727）和CD33（NCT02944162）。目前，有幾種針對血液惡性腫瘤的CAR－NK細胞臨床試驗正在進行中。

實體瘤

CAR治療的一個主要障礙是缺乏對實體瘤的療效。這是由于腫瘤灌注不良、TAA異質(zhì)性和實體瘤伴發(fā)的免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）所致。

CAR－NK療法試圖解決這些問題，一些臨床試驗已經(jīng)應用于實體惡性腫瘤的治療。在實體瘤中進展最為廣泛的CAR－NK療法包括檢查點分子程序性細胞死亡蛋白－1配體（PD－L1）以及常見的腫瘤相關(guān)抗原HER2和MUC1為靶點。

PD－L1在TME和免疫抑制細胞的幾種癌癥類型中上調(diào)。一種新的NK－92細胞系被設計成靶向PD－L1、ER保留的IL－2和高親和力CD16的CAR，稱為PD－L1靶向haNK（t－h(huán)aNK）。令人興奮的臨床前數(shù)據(jù)表明，這些細胞在體外對15種腫瘤細胞株具有特異的抗腫瘤作用，在體內(nèi)對三陰性乳腺癌、膀胱腫瘤和肺癌具有很強的抗腫瘤作用。QUITL3．064 I期臨床試驗（NCT04050709）目前正在進行，PD－L1 t－h(huán)aNK聯(lián)合其他藥物評估局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的安全性和有效性也在進行中（NCT0439099）。

HER2在幾種癌癥中過度表達，如乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌和子宮內(nèi)膜癌。HER2也在80％的膠質(zhì)母細胞瘤中表達，并且與低生存率相關(guān)。因此，HER2是CAR治療的一個非常有吸引力的靶點。HER2－CAR－T治療膠質(zhì)母細胞瘤已經(jīng)顯示出這些細胞被轉(zhuǎn)移到腫瘤中，但是在TME中高效應功能的T細胞導致抗原丟失變體的快速選擇。ErbB2－NK－92／5．28z CAR－NK將在潛在抗原丟失的情況下保持效應器功能，從而使過繼轉(zhuǎn)移細胞的細胞毒功能恢復到基線NK細胞的細胞毒功能。這項HER2－CAR－NK治療正在一項3＋3劑量遞增I期臨床試驗（CAR2BRAIN；NCT0338978）中。

MUC1是一種在導管上皮細胞上表達的高度糖基化跨膜糖蛋白，其在人類B細胞和T細胞上的表達存在爭議。MUC1在多種癌癥類型中過度表達，使其成為CAR－T治療的合適靶點。然而，CAR－T療法已被證明是不成功的，因為免疫抑制的TME。為了規(guī)避TME介導的免疫抑制，CAR－NK細胞被設計表達帶有CD28和CD137信號結(jié)構(gòu)域的MUC1－CAR和截短的PD－1肽（MUC1－CAR－NK－92）。這些細胞在體外和體內(nèi)均能殺傷MUC1靶細胞。最近完成了一項I期臨床試驗（NCT02839954），評估了Muc1－CAR－NK－92在Muc1陽性復發(fā)或難治性實體瘤患者中的安全性和有效性。13例PD－L1和MUC1陽性腫瘤患者中，3名退出，9名病情穩(wěn)定，1名患者病情進展。主要的觀察指標是確定Muc1－CAR－NK－92細胞的毒性，值得注意的是，試驗中沒有任何患者出現(xiàn)細胞因子風暴或骨髓抑制的跡象。

CAR－NK細胞面臨的臨床應用障礙

體外擴增NK細胞是CAR－NK細胞免疫治療的第一道障礙。單個供體的NK細胞數(shù)量不足以進行治療，這使得NK細胞的擴張和激活變得非常關(guān)鍵。這一生產(chǎn)過程通常需要兩到三周的時間來培養(yǎng)NK細胞和某些細胞因子（IL－2或與IL－15或抗CD3單克隆抗體聯(lián)合使用）。盡管輻照過的K562－mb15－4－1BBL細胞作為飼料可以改善NK細胞增殖過程中細胞的生長，但供體細胞數(shù)量的可用性仍然是一個障礙。此外，必須完全清除T細胞，以防止GVHD。因此，如何獲得足夠的NK細胞仍是一個挑戰(zhàn)。

選擇合適的方法將CAR轉(zhuǎn)化為NK細胞是CAR－NK細胞免疫治療的關(guān)鍵。到目前為止，病毒載體和非病毒載體都被用來轉(zhuǎn)化CAR。雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的轉(zhuǎn)染效率很高，但它可能會引起插入突變、致癌和其他不良反應。而慢病毒載體盡管顯示出較低的插入突變發(fā)生率，但其對外周血NK細胞的轉(zhuǎn)染效率低至20％。

mRNA轉(zhuǎn)染CAR－NK細胞也被認為是一種安全、實用的轉(zhuǎn)染方法。研究表明，在異種移植腫瘤模型中，用mRNA方法電穿孔24小時后受體表達水平超過80％，轉(zhuǎn)染mRNA的NK細胞表現(xiàn)出明顯的細胞毒性。最近有研究表明，轉(zhuǎn)染mRNA可以有效地避免CAR修飾免疫療法臨床應用的一個重要限制因素“靶向非腫瘤”毒性。然而，通過電穿孔方法轉(zhuǎn)染mRNA的CAR－NK細胞的抗腫瘤作用將是暫時的，因為CARs的表達水平不會超過3天。

新一代的CAR－NK

一些研究小組正在探索不同的機制來有效地對抗抗原丟失和免疫抑制TME，從而將提高CAR－NK治療策略的治療壽命和療效，并可能成為下一代CAR－NK治療的支柱。

為了避免抗原逃逸，Mitwasi和他的同事開發(fā)了一種通用型CAR（UniCAR），帶有開關(guān)，以提高安全性和可控性。這項技術(shù)首先在針對E5B9的CAR－T細胞上得到驗證，E5B9是核抗原La－SS／B的肽表位。由于在細胞表面沒有發(fā)現(xiàn)這種蛋白，CAR－T必須通過一種稱為靶模塊（TM）的雙特異性分子定向到腫瘤。TMs通常以E5B9肽表位融合到抗TAA的單鏈抗體上。不同的TM可以聯(lián)合應用，以同時針對多個TAA，誘導CARs反應肽的異質(zhì)性，而不存在靶向效應的風險。

Mitwasi等人開發(fā)了一個表達UniCAR的NK－92細胞系和一個TM，其中E5B9表位連接到IgG4主干上的抗GD2單抗。GD2在多種人類腫瘤中高表達，是神經(jīng)母細胞瘤的免疫治療靶點之一。以表達GD2的神經(jīng)母細胞瘤和黑色素瘤細胞為靶點的UniCAR NK－92在體外表現(xiàn)出抗腫瘤細胞毒性，已準備進一步的臨床開發(fā)。

CAR治療面臨的另一個挑戰(zhàn)是TME。為避免免疫抑制性TME，Wang等構(gòu)建了NK－92細胞，表達由細胞外TGFβRII融合到激活受體NKG2D的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導域組成的修飾CAR（TGFβRII－NKG2D，稱為NK－92－TN）。本質(zhì)上，這種融合將免疫抑制劑TME產(chǎn)生的TGF－β傳遞的信號轉(zhuǎn)換為激活信號。體外培養(yǎng)的NK－92－TN細胞對TGF－β抑制有抵抗力，無NKG2D下調(diào)，TGF－β共培養(yǎng)后殺傷能力和IFN－γ產(chǎn)生增加。雖然體外實驗數(shù)據(jù)看起來很有希望，但在體內(nèi)，NK－92－TN的抗腫瘤活性并不顯著，終點腫瘤重量的減少很小。在這方面還需要更深入的研究。

展望

自然殺傷細胞是一組獨特的抗腫瘤效應細胞，具有不受MHC限制的細胞毒性、產(chǎn)生細胞因子和免疫記憶等功能，使其成為先天性和適應性免疫反應系統(tǒng)中的關(guān)鍵角色。CAR－NK細胞療法是一個很有前途的臨床研究領(lǐng)域，對某些癌癥患者具有良好的安全性和初步療效。與CAR－T細胞相比，CAR－NK細胞具有自己獨特的優(yōu)點，但仍面臨著一些挑戰(zhàn)。這些挑戰(zhàn)包括細胞增殖的改善，使細胞毒性的激活更有效，以及最終找到NK細胞的最佳重建方法。相信解決好這些問題，基于NK細胞優(yōu)秀的抗腫瘤血統(tǒng)，極有可能在CAR修飾的武裝下為腫瘤治療帶來新的突破。

參考文獻：

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