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文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

氣單胞菌屬是人類、動(dòng)物和水生生物極其重要的傳染性病原體。該病原菌廣泛存在于水生環(huán)境中，多數(shù)菌株具有較高的致病性，可引起水生動(dòng)物疾病、導(dǎo)致水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)巨大的損失。此外，氣單胞菌還會(huì)引起人類腹瀉，且目前病例也日漸增加，對(duì)公共衛(wèi)生安全產(chǎn)生了嚴(yán)重的問題。疫苗接種被認(rèn)為是預(yù)防感染的有效策略。

氣單胞菌的毒力因子，主要包括脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMPs）、氣溶酶（Aer）、鞭毛蛋白（Fla）等。其中，鞭毛蛋白（fla）是細(xì)菌鞭毛的主要成分，主要包括flaA和flaB，具有良好的免疫原性，可作為血清學(xué)鑒定的基礎(chǔ)。鞭毛蛋白（FlaB）是氣單胞菌的多種毒力因子之一，可以作為一種良好的免疫抗原，可單獨(dú)免疫宿主，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，具有廣闊的發(fā)展前景。

黏膜是外來病原體與魚類接觸時(shí)遇到的第一道屏障，而魚會(huì)通過局部免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。與傳統(tǒng)免疫相比，黏膜免疫會(huì)產(chǎn)生高水平的抗體，強(qiáng)烈激活宿主T細(xì)胞和應(yīng)激反應(yīng)。特別是粘膜免疫非常適合于動(dòng)物間大規(guī)模傳染病的預(yù)防。因此，基于黏膜免疫制備的口服疫苗是治療魚類氣單胞菌感染等水生疾病的合適方法。采用黏膜免疫法制備的魚類口服疫苗比傳統(tǒng)的注射疫苗更具優(yōu)勢(shì)。

乳酸菌作為黏膜免疫的良好蛋白傳遞載體，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答和免疫耐受，被廣泛認(rèn)為是能夠抵抗腸道不良環(huán)境并完成定植和抗原呈現(xiàn)的疫苗載體。吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院和河北科技師范大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的Yi－Di Kong，Yuan－Huan Kang等人2019年在《Fish and Shellfish Immunology》雜志上（IF 2018＝3．185，農(nóng)林科學(xué)1區(qū)）發(fā)表了題為“Oral immunization with recombinant Lactobacillus casei expressing flab confers protection against Aeromonas veronii challenge in common carp，Cyprinus carpio”的文章。在本文中，作者研究開發(fā)了兩種木糖誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)氣單胞菌flaB的干酪乳桿菌菌株，并以免疫原性作為疫苗載體誘導(dǎo)魚對(duì)氣單胞菌的免疫應(yīng)答。

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所用到的主要方法

METHODS

1．質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)

2．Western blot

3．免疫熒光分析

4．ELISA

5．白細(xì)胞吞噬作用分析

6．qRT－PCR

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文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

用SmaI／EcoRV或BamHI／XhoI限制性內(nèi)切核酸酶消化flaB基因（900 bp）的純化PCR產(chǎn)物，分別插入pPG－1或pPG－2表達(dá)載體的相應(yīng)位點(diǎn)，得到pPG－1－flaB或pPG－2－flaB。重組的pPG－1－ flab和pPG－2－ flab經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化入干酪乳桿菌（Lactobacillus casei ）CC16，同時(shí)采用不含flaB基因（Lc－pPG）的pPG質(zhì)粒的干酪乳桿菌作為載體對(duì)照。實(shí)驗(yàn)首先采用Western blot分析及免疫熒光對(duì)重組flaB基因在干酪乳桿菌菌株中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析檢測(cè)。此外，利用PCR和測(cè)序技術(shù)篩選重組干酪乳桿菌，并分析了細(xì)胞的生長和遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒可以穩(wěn)定遺傳超過50代，外源抗原的表達(dá)和分泌對(duì)宿主菌細(xì)胞生長基本上沒有太大的影響。在口服重組干酪乳桿菌Lc－pPG－1－flaB和Lc－pPG－2－flaB免疫鯉魚后，魚體內(nèi)ACP、AKP、LZM、SOD活性增加，血清免疫指標(biāo)增強(qiáng)，免疫組織中IL– 10、IL－β、IFN－γ和TNF－α的表達(dá)增加。在腸道中能夠檢測(cè)到重組干酪乳桿菌的存活，并且，在用病原菌維隆氣單胞菌（Aeromonas veronii）攻擊宿主時(shí)，給予Lc－pPG－1－flaB（66．7％）和Lc－pPG－2－flaB（53．3％）免疫組的存活率均明顯高于對(duì)照組。

這些結(jié)果表明：flaB重組干酪乳桿菌可以定植到鯉魚的腸道，并促進(jìn)免疫應(yīng)答、增強(qiáng)鯉魚對(duì)氣單胞菌感染的抗病性，從而產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)作用。

干酪乳桿菌合成的新型納米硒可抑制大腸桿菌對(duì)腸屏障功能的破壞