01

文章背景簡介

BACKGROUND INTRODUCTION

真菌毒素是絲狀真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，可在田間以及收獲、運(yùn)輸、加工或儲存期間污染農(nóng)作物。聯(lián)合國糧農(nóng)組織（糧農(nóng)組織）估計(jì)，世界上25％的以作物為基礎(chǔ)的農(nóng)產(chǎn)品會受到真菌毒素污染，導(dǎo)致全球每年大約損失1億噸糧食。玉米赤霉烯酮（ZEN）是鐮刀菌真菌產(chǎn)生的一種類雌激素真菌毒素，是食品和飼料中最常見的真菌毒素之一。ZEN可以激活雌激素受體，會導(dǎo)致農(nóng)場動物的生殖障礙，偶爾也會導(dǎo)致人類出現(xiàn)高雌激素綜合征。因此，ZEN不僅會造成牲畜生產(chǎn)效率較低而引起重大經(jīng)濟(jì)損失，而且會對食用受ZEN污染食物的人構(gòu)成健康風(fēng)險。減少ZEN健康風(fēng)險的理想解決方案是避免食品和飼料中的ZEN污染。然而，這在目前的農(nóng)業(yè)實(shí)踐卻難以做到。因此，對已經(jīng)被ZEN污染的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行解毒處理是另一種不錯的選擇。食品和飼料中ZEN的去除方法包括化學(xué)方法，如將含有ZEN的食品暴露于臭氧或過氧化氫中；物理方法，如擠壓加工；生物方法，如使用生物轉(zhuǎn)化劑將ZEN降解為無毒代謝產(chǎn)物或使用吸附劑降低其生物利用度。 在這些ZEN解毒方法中，生物方法更為可取，因?yàn)樯�物法可以在溫和條件下去除真菌毒素，不必使用有害化學(xué)物質(zhì)，也不會造成食品和飼料營養(yǎng)價值和適口性的重大損失。

zhd101是一種由Clonostachys rosea菌產(chǎn)生的內(nèi)酯酶，它能將ZEN轉(zhuǎn)化為酮類物質(zhì)，這是一種毒性明顯較低的產(chǎn)品。在以前的研究中，zhd101已在大腸桿菌、釀酒酵母和水稻植株中成功表達(dá)，由這些轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)生的重組zhd101可有效降解ZEN。

益生菌一直被用作飼料添加劑，因?yàn)樗鼈冇惺鼓c道微生物群正常化，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)，預(yù)防腹瀉，提高飼料轉(zhuǎn)化效率等功能。雖然益生菌發(fā)揮了許多有益的作用，但有人推測，它們的特性可以通過遺傳修飾得到進(jìn)一步改善。羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）是動物腸道菌群中常見的潛在益生菌之一。Lactobacillus reuteri Pg4最初是從健康肉雞的胃腸道中分離出來的，已被證明能夠耐受酸、鹽和膽汁，抑制病原體生長，并能粘附粘蛋白和粘液。此外，Lactobacillus reuteri Pg4已被用于異源表達(dá)一些纖維分解酶，包括β－葡聚糖酶、木聚糖酶和纖維素酶等。重組Lactobacillus reuteri Pg4菌株已被證明能夠在不損失其益生菌特性的情況下分解纖維。

2017年4月24日，臺灣大學(xué)生物技術(shù)研究所Wen？Chun Yang等人在《Microbial Cell Factories》雜志（IF2017＝3．831，生物工程與應(yīng)用微生物2區(qū)）上發(fā)表了題為“Expression of the Clonostachys rosea lactonohydrolase gene by Lactobacillus reuteri to increase its zearalenone－removing ability”的文章。在該研究中，作者介紹了zhd101基因在Lactobacillus reuteri Pg4中的異源表達(dá)，并檢測了重組菌中異源酶的產(chǎn)生、酸和膽鹽耐受性以及粘附能力。

02

所用到的主要方法

METHODS

1、反轉(zhuǎn)錄聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)－RT－PCR

2、蛋白質(zhì)印記分析－WB

3、高效液相色譜－HPLC

4、耐酸耐膽鹽

5、細(xì)胞粘附性實(shí)驗(yàn)

03

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

在以前的研究中，本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)Lactobacillus reuteri Pg4表達(dá)纖維溶解酶，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的Lactobacillus reuteri菌株獲得了分解植物纖維的能力，從而導(dǎo)致肉雞體重增加、飼料轉(zhuǎn)化效率提高。本研究將zhd101基因?qū)�入到Lactobacillus reuteri Pg4中，轉(zhuǎn)化菌株Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101成功表達(dá)了zhd101，獲得了降解ZEN的能力。據(jù)我們所知，這是第一次報(bào)告成功表達(dá)ZEN降解酶的腸道乳酸桿菌。

在含有4．5 mg／L ZEN的MRS肉湯中培養(yǎng)3株Lactobacillus reuteri 14小時后，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101肉湯中的ZEN濃度下降了99．3％。Takahashi－Ando等人發(fā)現(xiàn)從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組zhd101在低于4．5的pH值下會發(fā)生不可逆地失活。為此，本實(shí)驗(yàn)在發(fā)酵過程中將Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101培養(yǎng)基的pH值維持在7．0，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101在這種培養(yǎng)條件下可以有效地去除ZEN。這些結(jié)果表明：由Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101產(chǎn)生的重組zhd101在pH7．0下呈活性形式。通常而言，豬小腸、盲腸和結(jié)腸的平均ph值分別為6．5、6．1和6．5，雞的作物、小腸、盲腸和結(jié)腸的平均ph值分別為6．1、6．4、6．4和6．6。由于這些動物腸道環(huán)境均呈弱酸性至中性，研究者認(rèn)為Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101產(chǎn)生的重組zhd101可以以活性形式直接輸送到腸道。

在之前的一項(xiàng)研究中，我們觀察到Lactobacillus reuteri Pg4在體外對酸性條件和膽汁鹽接觸具有抵抗力。在本研究中，所有三株Lactobacillus reuteri Pg4菌株在pH3．0下培養(yǎng)4小時后或在含有0．5％牛膽的MRS肉湯中培養(yǎng)24小時后均存活。此外，在酸性條件下或膽汁鹽存在下，Lactobacillus reuteri 轉(zhuǎn)化菌株的細(xì)菌計(jì)數(shù)與Lactobacillus reuteri Pg4的細(xì)菌計(jì)數(shù)沒有差異。這些結(jié)果表明：Lactobacillus reuteri Pg4菌株可以通過胃運(yùn)輸存活下來，并可能在腸道環(huán)境中存活，在那里它們可以有效工作。

Caco－2細(xì)胞系已廣泛用于益生菌體外黏附能力的評價。在這項(xiàng)研究中，將熒光標(biāo)記的Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101與Caco－2細(xì)胞孵育2h后，分析顯示Lactobacillus reuteri 細(xì)胞能粘附在Caco－2細(xì)胞上，而目前已證實(shí)益生菌可以與致病細(xì)菌競爭腸道上皮細(xì)胞上相同的結(jié)合位點(diǎn)。此外，重組益生菌分泌的特異性酶附著在小腸上皮細(xì)胞上，可直接作用于小腸消化道中的底物，在小腸消化道中可吸收大部分ZEN。因此，Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101粘附腸道粘膜細(xì)胞的能力延長了其在腸道中的停留時間，從而使其達(dá)到最大益生菌效果。

總的來說，本實(shí)驗(yàn)成功地在Lactobacillus reuteri 菌株中克隆了水解酶基因zhd101，并檢測確證該異源zhd101可在轉(zhuǎn)化株Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101中實(shí)現(xiàn)功能性的表達(dá)。異源蛋白zhd101的產(chǎn)生并不影響菌株的生長、耐酸耐膽鹽性，對Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101的粘附能力影響較小。因此，我們認(rèn)為Lactobacillus reuteri pNZ－zhd101有可能作為益生菌飼料添加劑用于ZEN的降解。

▼相關(guān)鏈接▼解毒毛孢酵母可將玉米赤霉烯酮降解為無雌激素活性的代謝產(chǎn)物