01

文章背景簡(jiǎn)介  

BACKGROUND INTRODUCTION

生物遺傳中心法則是指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯。RNA，特別是眾多非編碼RNA在多種細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。RNA能在細(xì)胞內(nèi)的特定時(shí)間和位置表現(xiàn)出復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)和功能，這些動(dòng)力學(xué)包括其表達(dá)、降解、易位、剪接和其他化學(xué)修飾的變化。

RNA結(jié)合蛋白（RBP）在RNA生物學(xué)功能發(fā)揮過(guò)程中承擔(dān)著至關(guān)重要的作用。除了自然界存在RNA結(jié)合蛋白以外，人們還利用合成生物學(xué)原理將具有不同功能的結(jié)構(gòu)域與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合起來(lái)，合成了具有全新功能的RNA結(jié)合蛋白。然而，無(wú)論是自然界存在或者是人工合成的RNA結(jié)合蛋白，它們的活性很難被調(diào)控。因此，發(fā)展活性可控的RNA結(jié)合蛋白將有望實(shí)現(xiàn)對(duì)活細(xì)胞RNA的控制。

光是一個(gè)理想的觸發(fā)器，因?yàn)樗�很容易獲得，高度可調(diào)，無(wú)毒，最重要的是，具有高時(shí)空分辨率。在一些研究中，研究人員嘗試通過(guò)使用紫外線(xiàn)控制RNA功能。從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因表達(dá)、核酶活性、CRISPR－Cas功能和蛋白質(zhì)－RNA交聯(lián)的光學(xué)控制。然而，生物學(xué)家對(duì)這些方法的接受程度有限，這可能是因?yàn)樽贤饩�(xiàn)輻射的毒性以及RNA合成相關(guān)的技術(shù)復(fù)雜性。RNA 功能可能由基因編碼的光開(kāi)關(guān)RBP進(jìn)行光遺傳學(xué)控制。光遺傳學(xué)是一種新興技術(shù)，基因編碼的光開(kāi)關(guān)蛋白具有靈活、高時(shí)空精度的特點(diǎn)。在真核細(xì)胞中，許多蛋白質(zhì)被認(rèn)為具有RBP的功能，它們控制著RNA代謝的幾乎所有方面，包括轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯、周轉(zhuǎn)和細(xì)胞定位。然而，關(guān)于天然光控制RBP的報(bào)道極為罕見(jiàn)。

2022年1月3日，華東理工大學(xué)Renmei Liu等在《Nature Biotechnology》（生物1區(qū)IF＝54．908）發(fā)表了題為“Optogenetic control of RNA function and metabolism using engineered light－switchable RNA－binding proteins ”的文章。該研究基于合成生物學(xué)及光遺傳學(xué)原理并結(jié)合全新的高通量篩選策略成功構(gòu)建了系列光控RNA效應(yīng)因子，實(shí)現(xiàn)了動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)RNA生成、剪接、運(yùn)輸、翻譯、降解等代謝活動(dòng)的時(shí)空精密控制。

02

所用到的主要方法

METHODS  

1． 蛋白質(zhì)表達(dá)和純化

2． 光譜分析

3． 分子排除色譜

4． 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

5． 雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)BiFC

6．  RT－qPCR

03

文章主要內(nèi)容摘要

ABSTRACT

RNA結(jié)合蛋白（RBP） 在細(xì)胞環(huán)境調(diào)節(jié)RNA功能方面發(fā)揮著重要作用，但我們?cè)跁r(shí)間和空間上控制RBP活性的能力是有限的。本實(shí)驗(yàn)中描述了LicV 工程，這是一種可光切換的RBP，它與特定的RNA序列結(jié)合以響應(yīng)藍(lán)光照射。當(dāng)與各種RNA效應(yīng)器融合時(shí)，LicV允許對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中的RNA定位、剪接、翻譯和穩(wěn)定性進(jìn)行光遺傳學(xué)控制。此外，LicV 輔助的CRISPR－Cas系統(tǒng)允許對(duì)轉(zhuǎn)錄和基因組位點(diǎn)標(biāo)記進(jìn)行有效和可調(diào)的光開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)。這些數(shù)據(jù)表明，光可切換RBP LicV，從而可以作為可編程支架，用于合成RNA 效應(yīng)器的時(shí)空控制。

本文中構(gòu)建了國(guó)際上首個(gè)人工合成的光控RNA結(jié)合蛋白LicV，并將LicV與CRISPR－Cas系統(tǒng)結(jié)合起來(lái)，發(fā)展了全新的LA－CRISPR系統(tǒng)。

       原文標(biāo)題 : 光控RNA聯(lián)合CRISPR-Cas技術(shù)，可時(shí)空精確操縱活細(xì)胞的RNA代謝與功能