為了探討蛋白質(zhì)水平上TECs中膠原蛋白修飾酶是否上調(diào)，作者對(duì)來(lái)自肺，腎和結(jié)直腸（CRC）腫瘤和結(jié)直腸肝轉(zhuǎn)移的144個(gè)預(yù)期收集的TEC和NEC樣本的內(nèi)部生成隊(duì)列進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析 （CRCLM）。

在來(lái)自NSCLC患者（n ＝ 27例）的TECs中，LOXL2是最高上調(diào)的蛋白（＞ 4倍），而PLOD1和PLOD2上調(diào)了1．7倍和1．9倍（圖7A）。對(duì)所有4種腫瘤類型的薈萃分析均確定了288種持續(xù)表達(dá)較高的蛋白，包括LOX、LOXL2、PLOD1和PLOD2（圖7B）。

圖7：A：來(lái)自NSCLC患者的TECs中蛋白質(zhì)表達(dá)差異 

B：TEC中過(guò)表達(dá)的蛋白質(zhì)在不同種類癌癥的情況

對(duì)持續(xù)表達(dá)水平較高的蛋白質(zhì)子集的GO富集分析顯示，高表達(dá)蛋白質(zhì)在糖酵解酶，生長(zhǎng)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架組織以及蛋白質(zhì)羥基化和交聯(lián)的基因集富集（圖7C和S8D）。

圖7C：蛋白質(zhì)的GO分析結(jié)果

作者將PLOD1，PLOD2和LOXL2以及蛋白質(zhì)羥基化基因確定為高度排名的靶標(biāo)，因此作者決定評(píng)估這些基因是否在功能上調(diào)節(jié)了血管的發(fā)芽。

與上述GO分析一致：

TEC中的遷移，增殖和血管發(fā)芽高于NEC（圖8A－8C）。

圖8A：NEC與TEC的劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 

B：3 H－胸苷摻入試驗(yàn)結(jié)果

圖8C：C：hcNEC和hcTEC球狀體發(fā)芽的明場(chǎng)照片（上圖）和形態(tài)定量（下圖）

HUVEC中PLOD1，PLOD2或LOXL2的沉默（沉默效率＞ 70％–80％；圖S8E）減少了EC遷移（圖8D），并削弱了HUVEC橢球中的血管發(fā)芽（圖8E和8F）

D：對(duì)照和PLOD1，PLOD2或LOXL2沉默（KD）EC劃痕試驗(yàn)定量結(jié)果 

E－F：使用對(duì)照和PLOD1，PLOD2或LOXL2沉默（KD）EC進(jìn)行的球狀體發(fā)芽的明場(chǎng)照片（E）和定量（F）

米諾地爾是一種藥理學(xué)上的PLOD阻斷劑，可在體外減少EC遷移（圖8G）。米諾地爾或賴氨酰氧化酶抑制劑β－氨基丙腈（BAPN）的施用可抑制體內(nèi)角膜血管生成（圖8H）。

圖8G：米諾地爾對(duì)PLODs具有藥理學(xué)抑制作用的EC的劃痕傷口遷移試驗(yàn) 

H：在用媒介物（CTRL），米諾地爾或β－氨基丙腈（BAPN）干預(yù)角膜燒灼誘導(dǎo)的損傷后的角膜血管新生。

總體而言，作者認(rèn)為功能驗(yàn)證表明，通過(guò)綜合分析確定的靶向基因可抑制血管發(fā)芽。

小結(jié)

在這篇文章中，作者針對(duì)人類，小鼠以及培養(yǎng)細(xì)胞株進(jìn)行表皮細(xì)胞的深入分析，確定了不同model中的EC的異質(zhì)性以及保守性，在確定EC亞型的研究中，作者不單單對(duì)自身數(shù)據(jù)集進(jìn)行探究，還引入了多個(gè)外部數(shù)據(jù)集對(duì)于相關(guān)結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。作者還通過(guò)使用免疫熒光染色，RNA定量熒光染色以及cytof的方法來(lái)多維度確定EC的分類。

文章的后半部分關(guān)注于腫瘤治療中的重要話題——抗血管生成進(jìn)行研究，作者首先對(duì)小鼠樣本中帶有的抗VEGF治療組進(jìn)行差異基因篩選構(gòu)建gene signature。為了確定相應(yīng)的治療靶點(diǎn)，作者首先鑒定了在研究中不同model最保守的EC亞型——tip EC，對(duì)該亞型進(jìn)行保守基因的計(jì)算以及驗(yàn)證。隨后，作者對(duì)這些鑒定出來(lái)的保守基因中膠原相關(guān)酶靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)多種手段及實(shí)驗(yàn)技術(shù)證明了膠原羥基化及交聯(lián)酶在肺癌EC細(xì)胞相關(guān)的血管生成的重要性。

作者在文章最后提到本文的局限性：首先，該研究中每種EC表型的生物學(xué)作用是推定的，需要進(jìn)行更進(jìn)一步功能驗(yàn)證以探測(cè)其生物學(xué)作用。其次，需要分析更多的患者，以探究患者之間的異質(zhì)性，以識(shí)別所有可能的TEC表型。第三，兩種物種的腫瘤生長(zhǎng)不同，患者來(lái)源的腫瘤表現(xiàn)出比小鼠更大的遺傳和環(huán)境異質(zhì)性，這種異質(zhì)性給研究TEC表型所帶來(lái)的干擾是不能忽視的。