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引言

自19世紀(jì)末現(xiàn)代藥物發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在一系列關(guān)鍵技術(shù)突破的促進(jìn)下，藥物發(fā)現(xiàn)的方法和藥物模式方面都發(fā)生了重大變化。20世紀(jì)50年代建立的X射線晶體，開(kāi)創(chuàng)了未來(lái)幾十年基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)。20世紀(jì)70年代重組DNA和雜交瘤技術(shù)的發(fā)現(xiàn)使得第一種重組蛋白療法成為可能，例如來(lái)自禮來(lái)/基因泰克的Humulin和來(lái)自Amgen的Epogen，以及第一個(gè)單克隆抗體藥物，Orthoclone OKT3。這些技術(shù)啟動(dòng)了一種新的生物藥形態(tài)，目前，單克隆抗體已成為治療開(kāi)發(fā)中最受歡迎的藥物形式。

然而，單克隆抗體單一靶向的局限性和不斷增長(zhǎng)的未滿足的臨床需求，促使研究人員進(jìn)一步研究具有多特異性的分子。多特異性抗體（MsAbs）能夠識(shí)別位于相同或不同靶標(biāo)上的兩個(gè)或多個(gè)表位，這種多重識(shí)別能力擴(kuò)展了常規(guī)單克隆抗體的功能，允許多種應(yīng)用，例如募集免疫細(xì)胞破壞腫瘤細(xì)胞或交聯(lián)不同的細(xì)胞表面蛋白。

MsAbs通常在其結(jié)合模塊的大小，構(gòu)型，價(jià)態(tài)，靈活性和接近角度以及它們的可開(kāi)發(fā)性，分布和藥代動(dòng)力學(xué)屬性方面有所不同。自然界現(xiàn)有的能夠結(jié)合的蛋白質(zhì)，如抗體和細(xì)胞因子，提供了有價(jià)值的結(jié)合模塊，其序列和折疊經(jīng)過(guò)數(shù)百萬(wàn)年的優(yōu)化。相比之下，人造模塊，如小蛋白和從頭合成蛋白，通過(guò)使用Alphafold2和Rosettafold等工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，也證明了人工合成轉(zhuǎn)化藥物發(fā)現(xiàn)的潛力。

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一、Fab

設(shè)計(jì)MsAbs的一種簡(jiǎn)單而簡(jiǎn)約的方法是使用IgG的Fab部分。Fabs由HC的VH和CH1結(jié)構(gòu)域以及整個(gè)LC（VL和CL）組成，形成了一個(gè)非常穩(wěn)定的異二聚體，其中大約100個(gè)殘基參與了多個(gè)穩(wěn)定接觸，包括氫鍵、鹽橋、疏水相互作用和范德華力。

此外，與scFv形成鮮明對(duì)比的是，F(xiàn)ab表面親水，易于暴露于溶劑，因?yàn)樗鼜腎gG中提取只需要在連接CH1和Ab鉸鏈的柔性接頭處進(jìn)行截?cái)�。因此，穩(wěn)定的蛋白質(zhì)核心和巨大的親水表面使Fabs成為組裝MsAbs的流行選擇，特別是對(duì)于高濃度和/或皮下給藥（SC）配制的藥物。然而，由兩條不同的多肽鏈組成的模塊需要異二聚體組裝，這是含有兩個(gè)或多個(gè)不同F(xiàn)ab的MsAbs的重要考慮因素，因?yàn)楸仨毐ＷC每個(gè)HC和LC的正確同源配對(duì)。由于異源IgG分子的單細(xì)胞表達(dá)可以產(chǎn)生多達(dá)10種不同的錯(cuò)配物種，因此人們開(kāi)發(fā)了許多工程化策略來(lái)實(shí)施正確的鏈配對(duì)，比如電荷配對(duì)突變（CPM），knob-into-hole（KiH）和單鏈Fabs（scFabs）等）。另一種方法涉及使用通用LC。這些通用LC可以與兩個(gè)或多個(gè)不同的HC配對(duì)。

目前，臨床試驗(yàn)中的MsAbs有大約58%含有至少一個(gè)Fab作為構(gòu)建模塊。此外，首批獲得美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）批準(zhǔn)的MsAbs之一，用于治療血友病的emicizumab，其中包含兩個(gè)共享一個(gè)共同LC的Fab。

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二、ScFv

scFv是通過(guò)靈活接頭連接重鏈（VH）和輕鏈（VL）可變區(qū)而產(chǎn)生的分子。最常見(jiàn)的接頭是（Gly4Ser）3，連接序列也可以定制為更具剛性甚至帶靜電。此外，scFv分子中的VH-VL或VL-VH取向影響該模塊的結(jié)合和可行性。scFv目前也是制備MsAbs非常有吸引力的模塊，因?yàn)閱蝹�(gè)多肽鏈避免了鏈配對(duì)的復(fù)雜性，并且大約只有Fab大小的一半。此外，它們可以使用多種接頭串聯(lián)融合到Fc的N和C末端和/或進(jìn)行兩到四個(gè)拷貝的串聯(lián)。

但是，由于該模塊缺少Fab的恒定區(qū)域CH1和CL，因此也不存在CH1-CL界面C末端的天然二硫鍵。盡管蛋白質(zhì)接頭可以幫助克服scFv在純化和儲(chǔ)存過(guò)程中固有的不穩(wěn)定性，但由于動(dòng)態(tài)VH/VL界面，熱穩(wěn)定性平均低于親本Fab。為了解決這個(gè)問(wèn)題，可以增加二硫鍵來(lái)加強(qiáng)這個(gè)界面并提高熱穩(wěn)定性。但同時(shí)也會(huì)使許多Fab在轉(zhuǎn)化為scFv時(shí)無(wú)法保留功能。目前，可以通過(guò)計(jì)算蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)來(lái)鑒定改善穩(wěn)定性的定制二硫鍵。

另外，scFv缺乏CH1/CL區(qū)域，動(dòng)態(tài)的VH/VL界面成為一個(gè)具有聚集傾向的關(guān)鍵區(qū)域。聚集通常與分子濃度相關(guān)，因此當(dāng)達(dá)到像抗體一樣的濃度時(shí)，含有scFv的MsAbs可能表現(xiàn)出較差的單分散性，因此限制了治療產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。但是，其簡(jiǎn)單平臺(tái)技術(shù)的吸引力加上開(kāi)發(fā)周期后期才會(huì)考慮的技術(shù)問(wèn)題，導(dǎo)致許多含有scFv的MsAbs進(jìn)入臨床。目前，正在臨床開(kāi)發(fā)的MsAbs中約有36%含有至少一種scFv作為模塊之一，其中blinatumomab是來(lái)自Amgen的兩種scFv串聯(lián)分子，于2014年獲得FDA批準(zhǔn)。

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三、納米抗體（VHH）

除IgG外，駱駝和鯊魚(yú)天然產(chǎn)生重鏈抗體，其中抗原結(jié)合區(qū)由重鏈（VHH）的單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域組成。此外，VHH也可以在表達(dá)人源化VHH的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中產(chǎn)生，或者通過(guò)展示技術(shù)篩選。這些VHH，也稱為納米抗體或單域抗體（SDAb），在MsAbs的組裝中具有巨大的優(yōu)勢(shì)：首先，它繞過(guò)了Fabs中同源HC/LC配對(duì)的需要，并避免了互連接頭的使用，例如scFv。此外，由于其12-15 kDa的緊湊結(jié)構(gòu)，VHH顯示出理想的可開(kāi)發(fā)性屬性，包括高產(chǎn)量，在高蛋白質(zhì)濃度低聚集，低粘度和高熱穩(wěn)定性。由于其絕佳的生物物理特性，VHH可能適合吸入給藥，因?yàn)樗鼈兊男〕叽绱_保了體循環(huán)中的半衰期短。此外，VHH的結(jié)合親和力可以高達(dá)皮摩爾級(jí)，即使沒(méi)有VL，也與最佳Fab或scFv分子的結(jié)合親和力相匹配。盡管最初對(duì)VHHs的非人源存在疑慮，但隨著2019年FDA批準(zhǔn)caplacizumab，這些問(wèn)題迅速得到緩解。模，進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)階段開(kāi)發(fā)的MsAbs約有10%含有VHH作為模塊之一。-

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四、抗體Fc

MsAbs極大地受益于Fc在部署鏈配對(duì)技術(shù)時(shí)異二聚化的能力。Fc異二聚化的兩種流行方法是使用KiH突變和CPM。KiH突變引入一個(gè)空間龐大的氨基酸，如一條鏈上的色氨酸或酪氨酸，另一條鏈上的小氨基酸如甘氨酸或丙氨酸，分別形成突起和口袋。雖然這種方法對(duì)于減少同型二聚體特別有效，但空穴同型二聚體仍然可以形成，并且必須通過(guò)額外的純化步驟與所需的異二聚體分離。相反，CPM在一條鏈上引入帶正電荷的殘基，在另一條鏈上引入帶負(fù)電荷的殘基，以促進(jìn)異二聚體的形成。這使得Fc成為產(chǎn)生需要不對(duì)稱形式分子的引擎，因?yàn)椴煌�的模塊可以連接到Fc的每一半的N和C端。此外，含有Fc的MsAbs，具有更高的表達(dá)產(chǎn)量和高溶解度，且易于通過(guò)蛋白A捕獲純化。最后，F(xiàn)c可以識(shí)別多種細(xì)胞表面上的幾種受體，可以對(duì)其進(jìn)行操作以改善功能。 毫不奇怪，目前在臨床試驗(yàn)中大部分MsAbs，約83%都含有Fc。更多FC工程化的細(xì)節(jié)可以參閱《抗體Fc工程化改造策略概覽》

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五、細(xì)胞因子

免疫系統(tǒng)擁有一系列復(fù)雜的細(xì)胞類型，這些細(xì)胞類型由一類分泌的細(xì)胞外信號(hào)蛋白（細(xì)胞因子）精心控制，通常小于30 kDa。迄今為止，已經(jīng)鑒定出100多種不同的細(xì)胞因子，每種細(xì)胞因子都具有獨(dú)特的免疫生態(tài)位，它們代表了一個(gè)現(xiàn)成的模塊庫(kù)，可以用于治療。毫不奇怪，目前在臨床試驗(yàn)中約有超過(guò)14%的MsAbs中攜帶細(xì)胞因子。然而，這些細(xì)胞因子通常表現(xiàn)出狹窄的治療窗口，主要是由于高毒性特征。這表明，為了發(fā)揮這些細(xì)胞因子的全部潛力，必須改善毒性特征。

細(xì)胞因子的可開(kāi)發(fā)性

當(dāng)重組表達(dá)時(shí)，許多細(xì)胞因子表現(xiàn)出聚集傾向，這會(huì)影響CMC，和潛在的免疫原性。這可能是由于大多數(shù)細(xì)胞因子由螺旋束基序組成并顯示多個(gè)結(jié)合界面，這通常為富含疏水性斑塊，這可能導(dǎo)致聚集。另一個(gè)是游離半胱氨酸的情況。IL-1家族顯示出多種游離半胱氨酸，使其易于通過(guò)非經(jīng)典二硫鍵聚集和/或在暴露于氧化環(huán)境的情況下導(dǎo)致效力降低。因此，需要引入了新的C到S替代來(lái)緩解這些問(wèn)題。例如，臨床上大多數(shù)IL-2分子都含有C125S突變，這對(duì)于避免開(kāi)發(fā)過(guò)程中的聚集至關(guān)重要。

調(diào)節(jié)細(xì)胞因子選擇性

細(xì)胞因子受體在不同細(xì)胞類型上以不同水平表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子受體親和力提供了偏向細(xì)胞類型的機(jī)會(huì)。例如IL-2，減弱與亞基IL-2Rα的結(jié)合減少了免疫抑制性Treg細(xì)胞的活化，導(dǎo)致更高的T效應(yīng)細(xì)胞活化。Neoleukin Therapeutics開(kāi)創(chuàng)了一種新的策略，通過(guò)設(shè)計(jì)具有定制功能和增強(qiáng)可開(kāi)發(fā)性的從頭合成細(xì)胞因子，比如Neo-2/15，將從頭合成的螺旋移植到天然IL-2骨架上，完全消除了與IL2Rα的結(jié)合，同時(shí)在這種螺旋束蛋白上建立了額外的穩(wěn)定性。

調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的靶向性

全身細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)的毒性促使這些細(xì)胞因子與其他靶向分子偶聯(lián)，目的是降低外周細(xì)胞因子活性。這些與細(xì)胞因子融合的模塊試圖將細(xì)胞因子定位于腫瘤微環(huán)境，并通過(guò)識(shí)別選定的腫瘤相關(guān)抗原（TAA）來(lái)降低外周活性。例如，羅氏已經(jīng)證明了與IL-2突變蛋白融合的TAA的幾個(gè)成功例子，包括PD-1，腫瘤抗原癌胚抗原（CEA）和成纖維細(xì)胞活化蛋白-α。

但是，為了使靶向方法產(chǎn)生效果，它必須驅(qū)動(dòng)綁定事件的順序。因此，確保識(shí)別TAA的模塊的結(jié)合親和力顯著高于細(xì)胞因子與其受體的親和力是關(guān)鍵。這通常對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行突變，以減弱結(jié)合親和力。

細(xì)胞因子的條件性激活

條件性激活策略試圖通過(guò)依賴于響應(yīng)組織特異性線索（即蛋白酶切割，靶標(biāo)重建，pH變化，小分子誘導(dǎo)的變構(gòu)）的蛋白質(zhì)生物傳感器來(lái)降低系統(tǒng)活性。例如，通過(guò)將肽甚至靶向受體與細(xì)胞因子融合來(lái)“掩蓋”促炎細(xì)胞因子活性。一旦這些分子到達(dá)靶組織，通常通過(guò)切割編碼腫瘤特異性蛋白酶的接頭來(lái)釋放細(xì)胞因子的完全活性。一個(gè)案例是與異二聚體Fc融合的IL-2突變蛋白，該異二聚體Fc通過(guò)金屬蛋白酶（MMP）可切割接頭攜帶融合在Fc N末端的IL2和IL-2Rβ。

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六、微小蛋白

雖然基于抗體的療法一直是主要的生物制劑，但其他類別的蛋白質(zhì)也在探索中。從歷史上看，使用非Ig或“替代”模塊的動(dòng)機(jī)通常是為了克服天然模塊的局限性，如穩(wěn)定性差、組織滲透性差、無(wú)法靶向細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或藥物輸送途徑（即靜脈注射）等。除了為這些缺點(diǎn)提供解決方案外，非Ig 模塊作為治療劑本身可能會(huì)提供不同的藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)特征，并可以獲得天然模塊無(wú)法獲得的靶結(jié)合界面。

通常，這些替代支架是來(lái)源于具有所需特性的蛋白質(zhì)的單結(jié)構(gòu)域。來(lái)源的蛋白可能是人類、細(xì)菌、無(wú)脊椎動(dòng)物，甚至是從頭設(shè)計(jì)的，大小范圍從4kDa到20kDa。

Monobodies, pronectins 和adnectins

與免疫球蛋白最相似的是Monobodies, pronectins 和adnectins，每個(gè)都包含一個(gè)纖連蛋白3型（TNF3）結(jié)構(gòu)域，由七條柔性環(huán)連接的反平行β鏈組成。通常，這些柔性環(huán)中的三個(gè)是多樣化的，用于以類似于抗體CDR的方式結(jié)合。這些特征使它們能夠作為不同靶標(biāo)的結(jié)合物，比如BMS-986089，一種adnectin-Fc融合，目前正處于脊髓性肌萎縮癥的III期臨床試驗(yàn)。

Anticalins

Anticalins基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白家族，參與親脂性物質(zhì)的細(xì)胞外運(yùn)輸。它們具有一個(gè)β折疊桶狀結(jié)構(gòu)，具有一個(gè)內(nèi)腔和四個(gè)高度靈活的環(huán)。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白與免疫球蛋白可變區(qū)的結(jié)構(gòu)相似性使其可以對(duì)柔性環(huán)進(jìn)行工程化設(shè)計(jì)，以靶向各種治療靶點(diǎn)。一個(gè)利用Anticalins結(jié)合的例子是PRS-343，一種目前處于II期臨床試驗(yàn)中的41BB/HER2雙特異性靶向藥物。

Affibodies

Affibodies是葡萄球菌蛋白A的衍生物，是少數(shù)細(xì)菌來(lái)源的模塊之一。它是一個(gè)高度穩(wěn)定的三α螺旋束結(jié)構(gòu)，其螺旋表面經(jīng)過(guò)重新設(shè)計(jì)，可以用于靶向。Affibodies的分子量約為6.5 kDa，是最小的模塊之一。這種較小的尺寸可能使其能夠靶向其他較大模塊無(wú)法到達(dá)的表位。然而，作為一種細(xì)菌蛋白，免疫原性可能是個(gè)問(wèn)題。

DARPin

DARPin是由兩個(gè)反平行α螺旋單元組成的模塊化蛋白，相鄰單元由β發(fā)夾連接。每個(gè)模塊單元由33個(gè)殘基組成，完整的蛋白可以由多達(dá)29個(gè)連續(xù)的重復(fù)單元組成，最常見(jiàn)的長(zhǎng)度是4到6個(gè)單元。這些蛋白與富含亮氨酸的重復(fù)蛋白有關(guān)，通常存在于脊椎動(dòng)物先天免疫系統(tǒng)的Toll樣受體中。與其他模塊的結(jié)合界面相比，DARPin界面具有很高的剛性，形狀最凹，這使得DARPin可能成為針對(duì)某些靶標(biāo)的更合適的結(jié)合支架。由DARPin組成的MsAb的一個(gè)例子是MP0250，這是一種由四個(gè)DARPin組成的單鏈三特異性分子。目前，它正處于針對(duì)多種適應(yīng)癥的II期臨床試驗(yàn)中。

Knottins

Knottins是長(zhǎng)度通常為30至50個(gè)氨基酸的短肽，具有由三個(gè)二硫鍵形成的高度穩(wěn)定的保守折疊。這組成了一個(gè)剛性支架，其中包含許多多樣化的柔性環(huán)。由于其體積小，Knottins會(huì)迅速?gòu)捏w內(nèi)清除。結(jié)蛋白是用于產(chǎn)生結(jié)合劑的最小模塊，有可能靶向一些蛋白上原本無(wú)法接近的表位。然而，迄今為止，絕大多數(shù)Knottins因其半衰期短而被用作診斷劑，尚未用于MsAbs。 

從頭合成的微小蛋白

從頭合成的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)使用基于生物物理特性和預(yù)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的大數(shù)據(jù)集的預(yù)測(cè)算法指導(dǎo)的計(jì)算工具來(lái)生成人造蛋白質(zhì)折疊，甚至是具有自然界中沒(méi)有的氨基酸序列的完整蛋白質(zhì)。從頭開(kāi)始的微小蛋白是一類新的、快速發(fā)展的模塊形式，有可能加速功能性MsAb的發(fā)現(xiàn)。然而，從頭合成的小蛋白應(yīng)該被視為一把雙刃劍：一種具有更快時(shí)間線、優(yōu)化可開(kāi)發(fā)性、新功能或定制條件激活潛力的高度動(dòng)態(tài)模塊，但也是一種由幾乎沒(méi)有人類同源性的氨基酸序列組成的具有固有免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的模塊。Neo-2/15就是一種最具體內(nèi)特征的新生微小蛋白，模擬人類IL-2。

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結(jié)語(yǔ)

多特異性抗體無(wú)疑是下一代生物藥的重要方向，它們潛力巨大，但也面臨著前所未有的復(fù)雜性和開(kāi)發(fā)挑戰(zhàn)。要真正邁向下一代，關(guān)鍵在于深刻理解我們使用的各種構(gòu)建模塊的特性，以及它們成功組裝成復(fù)雜四級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)在規(guī)則。這意味著，我們?cè)谶x擇這些模塊時(shí)，不僅要考慮它能做什么，還要考慮它本身的表達(dá)、穩(wěn)定性、純化難易度、與其他模塊的兼容性等等。

同時(shí)，我們也要認(rèn)識(shí)到，計(jì)算蛋白設(shè)計(jì)，特別是機(jī)器學(xué)習(xí)的革命性整合，正在為這個(gè)領(lǐng)域帶來(lái)前所未有的機(jī)遇。通過(guò)將這些智能工具融入到工作流程中，我們有望實(shí)現(xiàn)更智能、更高效、更可預(yù)測(cè)的多特異性抗體開(kāi)發(fā)，最終更快地將這些能解決未滿足醫(yī)療需求的創(chuàng)新療法帶給患者。

參考資料：

1.Next generation of multispecific antibody engineering. Antib Ther. 2023 Dec 8;7(1):37–52

       原文標(biāo)題 : 下一代多特異性抗體的構(gòu)建模塊